Preparazione di grandi campioni biologici per alta

Nature Protocols volume 18, pagine 1441–1461 (2023)Citare questo articolo

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L'imaging su scale diverse è essenziale per comprendere la morfologia degli organi sani e i cambiamenti fisiopatologici. La morfologia tridimensionale su macro e microscala di campioni di grandi dimensioni, inclusi organi umani intatti, è possibile con la microtomografia a raggi X (utilizzando sorgenti di laboratorio o di sincrotrone). La preparazione di campioni di grandi dimensioni per l'imaging ad alta risoluzione, tuttavia, è impegnativa a causa di limitazioni quali la contrazione del campione, il contrasto insufficiente, il movimento del campione e la formazione di bolle durante il montaggio o la scansione. Qui descriviamo la preparazione, la stabilizzazione, la disidratazione e il montaggio di grandi campioni di tessuti molli per la microtomografia a raggi X. Descriviamo in dettaglio il protocollo applicato a interi organi umani e alla tomografia gerarchica a contrasto di fase presso l'European Synchrotron Radiation Facility, ma è applicabile a una gamma di campioni biologici, inclusi organismi completi. Il protocollo migliora il contrasto quando si utilizza l'imaging a raggi X, prevenendo al contempo il movimento del campione durante la scansione, anche con orientamenti diversi del campione. Le bolle intrappolate durante il montaggio e quelle formate durante la scansione (nel caso dell'imaging a raggi X al sincrotrone) vengono mitigate da molteplici fasi di degasaggio. La preparazione del campione è compatibile anche con la risonanza magnetica, la tomografia computerizzata e l'osservazione istologica. La preparazione e il montaggio del campione richiedono 24-36 giorni per un organo di grandi dimensioni come un intero cervello o cuore umano. Il tempo di preparazione varia a seconda della composizione, dimensione e fragilità del tessuto. L'uso del protocollo consente la scansione di organi intatti con un diametro di 150 mm con una dimensione del voxel locale di 1 μm. Il protocollo richiede utenti con esperienza nella gestione di organi umani o animali, operazioni di laboratorio e imaging a raggi X.

La quantificazione della morfologia degli organi umani, sia in salute che in malattia, è un compito complesso che può essere affrontato mediante modalità di imaging spaziale multimodale, in grado di estendersi su scale dimensionali. La caratterizzazione morfologica completa dei tessuti richiede il rilevamento delle interazioni tra e attraverso le scale; tuttavia, la maggior parte delle tecniche di imaging sono limitate dalla risoluzione o dal campo visivo, rendendo difficile il collegamento tra osservazioni e dati macroscopici e microscopici. Gli approcci convenzionali all'istologia1,2,3 o alla microscopia elettronica4,5,6 consentono la visualizzazione dell'organizzazione microstrutturale e della composizione del tessuto attraverso sezioni seriali e i dati possono essere opportunamente quantificati; tuttavia, questi approcci richiedono normalmente il campionamento e il sezionamento del tessuto e richiedono molto tempo e manodopera. Lo schiarimento ottico combinato con la microscopia a foglio luminoso può fornire un ampio campo visivo con alta risoluzione; tuttavia, anche la depurazione dei tessuti richiede tempi lunghi ed è spesso costosa; inoltre, la profondità dell'immagine per un microscopio a lastra leggera è limitata dalla distanza di lavoro della lente dell'obiettivo7,8. Anche nel caso in cui interi organi umani adulti8 o interi animali9 siano stati eliminati in un periodo di diversi mesi, la loro imaging rimane impegnativa. Inconvenienti simili si applicano alla tomografia a coerenza ottica10,11, alla microscopia multifotone12 o alla microscopia confocale13,14, che può catturare la microstruttura tridimensionale (3D) locale del tessuto su scala cellulare, ma ha una penetrazione tissutale limitata, ostacolando l'imaging dei tessuti profondi15. Recentemente, la risonanza magnetica (MRI) ad alta risoluzione ha raggiunto una dimensione isotropica del voxel di 100 µm in un intero cervello umano ex vivo16. Sebbene la risonanza magnetica sia non distruttiva e abbia un ampio campo visivo17, la risoluzione non è ancora sufficiente per esaminare la microstruttura dei tessuti. Le tecniche di imaging gerarchico sono in grado di superare il compromesso tra risoluzione e campo visivo. In un approccio gerarchico, più immagini dello stesso campione vengono acquisite a diverse risoluzioni per colmare le diverse scale. La tomografia microcomputerizzata (μCT) è stata utilizzata per visualizzare l'immagine di interi polmoni con una risoluzione di 150 μm di voxel, seguita dalla successiva estrazione dei nuclei bioptici nei polmoni; questi piccoli nuclei sono stati quindi scansionati con µCT per ottenere voxel da 10 μm18.